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不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理
點擊次數:32 更新時間:2025-03-27

  定義:在一個凝膠電泳系統中不同部位的pH、離子強度、緩沖液成分或凝膠孔隙大小不同的凝膠電泳。其目的在于提高電泳分離的范圍和分辨率。

  不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳包含了兩種以上的緩沖液成分、pH值和凝膠孔徑,而且在電泳過程中形成的電位梯度亦不均勻。由此產生的濃縮效應、電荷效應和分子篩效應。

  不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理

  1.濃縮效應樣品在電泳開始時,通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層(一般能濃縮幾百倍),然后再被分離。當通電后,在樣品膠和濃縮膠中,解離度最大的Cl—有效遷移率最大,被稱為快離子,解離度次之的蛋白質則尾隨其后,解離度最小的甘氨a酸離子(PI=6.0)泳動速度最慢,被稱為慢離子。由于快離子的迅速移動,在其后邊形成了低離子濃度區域,即低電導區。電導與電勢梯度成反比,因而可產生較高的電勢梯度。這種高電勢梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。因而在高電勢梯度和低電勢梯度之間形成一個迅速移動的界面,由于樣品中蛋白質的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間,所以,也就聚集在這個移動的界面附近,逐漸被濃縮,在到達小孔徑的分離膠時,已形成一薄層。

  2.電荷效應當各種離子進入pH8.9的小孔徑分離膠后,甘氨a酸離子的電泳遷移率很快超過蛋白質,高電勢梯度也隨之消失,在均一電勢梯度和pH的分離膠中,由于各種蛋白質的等電點不同,所帶電荷量不同,在電場中所受引力亦不同,經過一定時間電泳,各種蛋白質就以一定順序排列成一條條蛋白質區帶。

  3.分子篩效應由于分離膠的孔徑較小,分子量大小或分子形狀不同的蛋白質通過分離膠時,所受阻滯的程度不同,因而;遷移率不同而被分離。此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時,受阻滯的程度不同,小分子走在前面,大分子走在后面,各種蛋白質按分子大小順序排列成相應的區帶。

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